正常細胞代謝所需的能量主要由線粒體氧化磷酸化產生的ATP提供，而腫瘤細胞即便氧供充足也偏好利用糖酵解供能。腫瘤細胞的糖酵解代謝為其提供充足的ATP，利于其生長增殖。近年來，針對腫瘤細胞能量代謝的研究受到廣泛關注，基于腫瘤能量代謝的內在分子機制研究，將對腫瘤治療提供新的指導方向。N6-甲基腺嘌呤（m6A）mRNA修飾在細胞的生物學功能具有多種調控作用。研究發現腫瘤細胞的m6A修飾調控腫瘤的生長、增殖及轉移，然而m6A修飾是否參與腫瘤細胞的能量代謝中尚待深入研究。
近日，我校藥學院王紅勝教授課題組在Nature Communications期刊上發表題為“N6-methyladenosine regulates glycolysis of cancer cells through PDK4” 的研究論文，發現RNA的m6A修飾對腫瘤細胞的能量代謝有積極調節作用，其可通過丙酮酸脫氫酶激酶4（PDK4）參與腫瘤細胞的糖酵解和ATP生成。
m6A調控PDK4翻譯及mRNA穩定性介導腫瘤細胞糖酵解示意圖
本研究發現，m6A修飾參與腫瘤細胞的糖酵解和ATP生成。甲基轉移酶METTL3的缺失使得m6A水平下調，并抑制腫瘤細胞的葡萄糖攝入、乳酸產生速率和ATP生成。m6A-seq和功能實驗表明，PDK4的表達受m6A調控，且過表達PDK4能逆轉METTL3缺失導致的腫瘤細胞糖酵解和ATP生成抑制。進一步研究表明，PDK4 mRNA的5’UTR區而非3’UTR區的m6A修飾，可通過與YTHDF1/eEF-2復合物和IGF2BP3結合，從而正向調節其mRNA的翻譯延伸及mRNA穩定性。此外，TATA結合蛋白（TBP）可以通過與METTL3啟動子結合增強其轉錄及在宮頸癌細胞中的表達。體內和臨床分析表明，m6A/PDK4在宮頸癌和肝癌組織表達上調，且對其發生發展具有促進作用。
此外，王紅勝課題組還在Nucleic Acids Research期刊上發表題為“Targeted mRNA demethylation using an engineered dCas13b-ALKBH5 fusion protein”的研究論文，成功構建基于dCas13b-ALKBH5的融合蛋白體系dm6ACRISPR，實現在活細胞內靶向mRNA進行去甲基化修飾。同時，在腫瘤細胞中運用dm6ACRISPR靶向促癌基因EGFR和MYC，可顯著降低其表達和抑制腫瘤細胞的生長。
RNA甲基化修飾約占所有RNA修飾的60%以上，而N6-甲基腺嘌呤（N6-methyladenosine, m6A）是高等生物mRNA中最為普遍的轉錄后修飾。m6A修飾由“編碼器（Writer）”、“消碼器（Eraser）”和“讀碼器（Reader）”共同調控其動態變化。其中，FTO和ALKBH5是目前已知的去甲基化酶，可“擦除”mRNA上的m6A修飾。m6A修飾對細胞各生物學行為具有多種調控作用，然而在活細胞內探討m6A修飾在靶mRNA上的具體作用尚未能實現。近年來基于CRISPR/Cas體系發展而來的基因編輯技術發展迅速，其中，酶失活型DNA結合酶dCas9聯合功能蛋白所構建的融合蛋白體系可在活細胞內定向改造DNA的表觀遺傳修飾。與Cas9功能相似，Cas13b可結合并剪切RNA，而酶失活型Cas13b（dCas13b）聯合gRNA可在活細胞內結合靶mRNA，使活細胞內的mRNA表觀遺傳修飾編輯變成可能。
dm6ACRISPR去甲基化編輯示意圖
本研究利用dCas13b融合去甲基化酶ALKBH5，結合靶向mRNA的gRNA，構建出可在活細胞內靶向mRNA的m6A去甲基化修飾體系dm6ACRISPR。該體系具有特異性強、去甲基化效率高和脫靶率低等特點。研究表明，dm6ACRISPR可實現CYB5A mRNA的單位點及CTNNB1 mRNA的多位點去甲基化，提高靶mRNA穩定性。同時，dm6ACRISPR具有高度錯配不耐受的特點，其細胞內脫靶率僅為0.03%。此外，在腫瘤細胞中運用dm6ACRISPR體系靶向促癌基因EGFR和MYC，可顯著降低其表達水平，同時明顯抑制腫瘤細胞生長，表明dm6ACRISPR在疾病防治上具有潛在價值。
上述研究工作獲得國家自然科學基金等多項基金的資助，及中山大學第一附屬醫院林水賓研究員、德州大學西南醫學中心江正明教授等課題組的幫助。
論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-16306-5
https://academic.oup.com/nar/article-lookup/doi/10.1093/nar/gkaa269
