中大新聞網訊（通訊員楊建華）信使RNA(mRNA)和非編碼RNA(ncRNA)上有超過170種不同類型的化學修飾—統稱為表觀轉錄組（Epitranscriptome）。絕大多數修飾（如：m6A、m5C）都是發生在RNA的堿基上，而2'-O-甲基化修飾(2'-O-Methylation, Nm)是發生在RNA的核糖上最豐富的修飾，并廣泛存在于各種生物的各類RNA中。它參與調控RNA的穩定性、結構形成、生物生成及mRNA的剪接和翻譯等，并與各種疾病密切相關。重要的是，2'-O-甲基化修飾是真核生物用于區分自己和非己mRNA的分子信號，在免疫系統中起著重要的作用。然而，由于目前檢測2'-O-甲基化修飾方法的局限性，它在低豐度的ncRNA和mRNA的精確分布圖譜、動態變化、功能和機制仍有待闡明。
近日，中山大學生命科學學院楊建華/屈良鵠教授團隊開發了在全轉錄組單堿基分辨率檢測2'-O-甲基化修飾位點的Nm-REP-seq新技術，并在人、小鼠和果蠅等組織和細胞中系統鑒定mRNA和ncRNA內部及末端的2’-O-甲基化修飾位點。團隊開發了基于核酸外切酶MgR（Mycoplasma genitalium RNase R）富集2'-O-甲基化修飾RNA和2'-O-甲基化修飾耐受NaIO4氧化的新方法Nm-REP-seq（圖1）。該方法使用的RNA 3'-5'核酸外切酶MgR消化RNA時會停止在含有2'-O-甲基化修飾的核苷酸下游的一位核苷酸位置。基于MgR的這一重要特性，Nm-REP-seq可以顯著的富集2'-O-甲基化修飾位點。進一步結合2輪氧化—消除核苷酸—去磷酸化（oxidation-elimination-dephosphorylation，OED）步驟，可以消除MgR處理后的2'-O-甲基化修飾的下游核苷酸，精確地定位2'-O-甲基化修飾位點。結合以上提及的酶學和化學兩種不同的正交方法和新的計算機分析方法，Nm-REP-seq具有非常高的特異性去鑒定各類RNA的2'-O-甲基化修飾位點。
圖1：開發Nm-REP-seq新技術在全轉錄組單堿基分辨率檢測2'-O-甲基化修飾位點
應用Nm-REP-seq技術于人、小鼠和果蠅等的組織或細胞RNA，Nm-REP-seq鑒定已知的2'-O-甲基化修飾位點的精確度高達98%和靈敏度達到82%以上。重要的是，Nm-REP-seq除了在mRNA鑒定大批新的修飾位點，還首次發現snoRNA、scaRNA、端粒酶RNA（TERC RNA）等RNA分子上存在2'-O-甲基化修飾。進一步提升Nm-REP-seq的文庫構建策略，Nm-REP-seq還可以用于鑒定各類RNA的3'末端的2'-O-甲基化修飾，并首次發現snoRNA、snRNA和tRNA末端及其加工產生的功能小RNA分子（如：tRF，snoRF，snRF）的末端存在2'-O-甲基化修飾。有趣的是，Nm-REP-seq不僅發現某些2'-O-甲基化修飾受到snoRNA的指導，還發現可能存在一個甲基轉移酶特異識別tRNA的T-Loop上固定位置的2'-O-甲基化修飾的生成。此外，該研究為了分析Nm-REP-seq產生的大規模測序數據，還開發了基于4個重要罰分特征的endSeeker計算機軟件和用于可視化RNA修飾的基因組區域瀏覽器trackBrowser（圖2）。
圖2：開發trackBrowser軟件展示Nm-REP-seq鑒定的2’-O-甲基化修飾位點
Nm-REP-seq聯合酶學和化學方法克服了化學法或引物延伸法的多個局限性，優越性體現如下：不依賴于RNA片段的大小；文庫起始RNA需求量少；避免RNA高級結構和其它RNA修飾影響；特異性和靈敏度高。將來進一步的提升Nm-REP-seq的建庫策略也將能用于鑒定mRNA帽子端2'-O-甲基化修飾。綜上，該研究不僅鑒定2'-O-甲基化修飾在各類RNA的精確分布圖譜，也為進一步闡明2'-O-甲基化修飾的生成機制及其在生理和病理過程中的作用提供了新方法。
該研究以“Single-base Resolution Mapping of 2'-O-Methylation Sites by an Exoribonuclease-Enriched Chemical Method”為題發表在Science China Life Sciences。中山大學生命科學學院楊建華教授、屈良鵠教授和特聘副研究員李斌為該項工作的共同通訊作者，博士研究生張萍和黃鈞鴻為本文共同第一作者。該研究得到了國家自然科學基金、國家重點研發計劃等項目資助。
論文鏈接：https://www.sciengine.com/SCLS/doi/10.1007/s11427-022-2210-0
開發的endSeeker軟件(C/C++編程語言)：https://github.com/sysu-software/endSeeker
開發的trackBrowser軟件（Perl編程語言）：https://github.com/junhong-huang/trackBrowser
