中大新聞網(wǎng)訊（通訊員胡友金、唐艷麗）視網(wǎng)膜神經(jīng)發(fā)育和再生的分子機(jī)制復(fù)雜，涉及DNA變異、表觀遺傳修飾、RNA轉(zhuǎn)錄和剪接等，多組學(xué)整合分析被認(rèn)為是揭示神經(jīng)干細(xì)胞譜系分化和再生分子機(jī)制的有效手段。由于神經(jīng)發(fā)育和再生過程中多個(gè)神經(jīng)譜系交錯(cuò)在一起，如何準(zhǔn)確地分辨不同譜系并系統(tǒng)描繪其多維分子特征的動(dòng)態(tài)變化，是精準(zhǔn)解析其分子機(jī)制的關(guān)鍵所在。近年來，單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，為分析神經(jīng)元發(fā)育和再生復(fù)雜分子機(jī)制提供了有力方法。然而，RNA可變剪接作為調(diào)控基因功能的重要環(huán)節(jié)，尚缺乏有效的單細(xì)胞多組學(xué)關(guān)聯(lián)分析方法。
2024年9月13日，中山大學(xué)中山眼科中心胡友金教授團(tuán)隊(duì)在Nature Communications雜志在線發(fā)表了題為“Simultaneous profiling of RNA isoforms and chromatin accessibility of single cells of human retinal organoids”的研究論文，報(bào)道了一種名為scRICA-seq (single-cell RNA isoform and chromatin accessibility sequencing) 的單細(xì)胞多組學(xué)測(cè)序方法，該技術(shù)能夠同時(shí)檢測(cè)單細(xì)胞水平染色質(zhì)可及性、RNA表達(dá)，以及 isoform全長(zhǎng)結(jié)構(gòu)，實(shí)現(xiàn)了單個(gè)細(xì)胞水平的表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄與RNA剪接的整合分析，為揭示視網(wǎng)膜神經(jīng)元發(fā)育和再生的新機(jī)制提供技術(shù)支撐。
胡友金團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期專注于單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的創(chuàng)新開發(fā)。早在2020年，該團(tuán)隊(duì)已在《Nature Communications》上發(fā)表scRCAT-seq技術(shù)，用于RNA isoform的檢測(cè)。此次，團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步改進(jìn)原有方法，發(fā)展了scRCAT-seq2全長(zhǎng)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，并結(jié)合10x Genomics的Chromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC + Gene Expression平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)了染色質(zhì)可及性與RNA isoform同時(shí)檢測(cè)的多組學(xué)方法。其中，scRCAT-seq2的核心技術(shù)是通過單分子成環(huán)技術(shù)處理cDNA，并將覆蓋TSS，TES和exon的測(cè)序序列進(jìn)行同一標(biāo)簽標(biāo)記，并組裝構(gòu)建全長(zhǎng)cDNA序列。（圖1）
圖1：scRICA-seq和scRCAT-seq2的示意圖
研究者將scRCAT-seq2在低通量與高通量條件下與多種三代測(cè)序技術(shù)（如SCAN-seq2、scISOr-seq、HIT-scISO-seq等）進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示scRCAT-seq2在成本效益和檢測(cè)靈敏度方面均具有顯著優(yōu)勢(shì)。（圖2）
圖2：scRCAT-seq2與其他方法比較分析圖
研究者將scRICA-seq應(yīng)用于人類視網(wǎng)膜發(fā)育過程，構(gòu)建了人類視網(wǎng)膜類器官的單細(xì)胞多組學(xué)圖譜。基于單細(xì)胞異構(gòu)體的聚類分析，確定了六個(gè)細(xì)胞簇，對(duì)應(yīng)于六種典型的視網(wǎng)膜早期神經(jīng)元，包括視網(wǎng)膜祖細(xì)胞（RPCs）、視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（RGCs）、無(wú)長(zhǎng)突細(xì)胞/水平細(xì)胞（AC/HCs）、視錐細(xì)胞前體（PR precursors）、神經(jīng)生成RPCs（neurogenic RPCs）以及視錐細(xì)胞（cones），其結(jié)果與scRNA-seq技術(shù)所得數(shù)據(jù)高度一致。（圖3）
圖3：基于scRICA-seq的人類視網(wǎng)膜類器官的多組學(xué)單細(xì)胞圖譜
進(jìn)一步，作者研究了RPC分化為cone過程中RNA isoform的動(dòng)態(tài)選擇模式，發(fā)現(xiàn)cone和RPC之間共有2292種差異表達(dá)的isoform，其中1143種isoform在cone中高度表達(dá)，1149種在RPC中高度表達(dá)。通過轉(zhuǎn)錄因子motif分析，研究者預(yù)測(cè)了589個(gè)可能與這些動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的剪接位點(diǎn)結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。在預(yù)測(cè)的轉(zhuǎn)錄因子中包含了11種先前報(bào)道的參與調(diào)節(jié)RNA剪接的轉(zhuǎn)錄因子，包括NEUROD1、SP1和KLF4等，同時(shí)還包含了已知的細(xì)胞命運(yùn)決定因子，如NEUROD1、ASCL1和THRB等。這提示，剪接位點(diǎn)染色質(zhì)可及性的動(dòng)態(tài)變化與RNA剪接可能協(xié)同調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)決定（圖4）。
圖4：RPC發(fā)育過程中RNA isoform選擇與染色質(zhì)可及性和TFs的相關(guān)性
綜上所述，scRICA-seq在單細(xì)胞水平實(shí)現(xiàn)了表觀遺傳學(xué)、RNA轉(zhuǎn)錄和剪接的整合分析，發(fā)現(xiàn)染色質(zhì)可及性和命運(yùn)決定因子協(xié)同調(diào)控下游基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄剪接，為闡明視網(wǎng)膜神經(jīng)元發(fā)育和命運(yùn)決定的機(jī)制提供了新思路。
本研究由中山大學(xué)中山眼科中心胡友金教授課題組完成。中山眼科中心張淑堯（研究助理）、肖玉華（博士研究生）、莫新枝（研究助理）為共同第一作者，胡友金教授為唯一通訊作者。中山大學(xué)中山眼科中心、眼病防治全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室為第一作者單位和通訊作者單位。
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https://www.nature.com/articles/s41467-024-52335-0
