CRISPR/Cas（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/ CRISPR-associated protein）系統是一種源于細菌和古細菌的抗病毒獲得性免疫機制。CRISPR/Cas系統以RNA蛋白質復合體的形式發揮免疫作用，其中效應蛋白包括Cas9，Cas12a，Cas12b，CasX等。經科學家改造將crRNA和tracrRNA合二為一形成單鏈引導RNA（guide RNA，gRNA）。Cas蛋白首先識別基因組上的PAM(Protospacer adjacement motif)序列，然后gRNA 特異性識別并與靶位點互補配對，從而激活Cas蛋白發揮核酸內切酶的功能切割DNA雙鏈，實現特定位點的基因編輯。自開發成為有效的基因編輯工具以來在各種生物體中得到了廣泛的應用，來自化膿鏈球菌(Streptococcus pyogenes, Sp)的CRISPR/Cas9系統是其中應用最廣泛的基因編輯工具。然而，由于人類遺傳變異多為點突變、插入或缺失，而CRISPR/Cas9系統通過同源重組的方式實現精確的堿基修復的效率低下，且在修復過程中會導致雙鏈損傷引發脫靶風險，限制了CRISPR/Cas9系統在精確的堿基修復領域的應用 (Science 2012; Science 2013; Cell 2017; Nature Biotechnology 2020)。
在Cas9 H840A切口酶(Cas9n-H840A切口酶)的C端融合逆轉錄酶，并在向導RNA(sgRNA)的基礎上進行改造，使其包含一段誘導目標堿基突變的RT模板以及引物結合位點(primer binding site，PBS)，從而構建得到引導編輯技術的向導RNA(prime editing guide RNA，pegRNA，獲得目標Prime editing（PE）系統。PE系統通過pegRNA靶向基因組內特定位點，而被Cas9n-H840A切口酶切斷的非互補鏈與pegRNA攜帶的PBS結構結合，在逆轉錄酶作用下，利用逆轉錄模板（RT template）進行修復，從而在靶位點實現特定堿基的轉換、插入和缺失 (Nature 2019)。
但由于PE編輯系統的蛋白編碼序列長達6.2kb，因此無法高效地裝載到單個裝載容量僅為4.7kb腺相關病毒（adeno-associated virus，AAV），進而限制其在體內治療研究。因此克服AAV病毒的承載能力限制，體內呈遞高活性的引導編輯器是目前亟待解決的難題 (Nature 2019; Nature Reviews Genetics 2020)。
為解決該難題，我校生命科學學院黃軍就教授課題組將PE科學地拆分至兩個不同的AAV上，通過內含肽（intein）使它們能在細胞內重新合并成全長具有功能的PE蛋白，構建雙AAV介導的Split-PE系統。首先在體外成功篩選出具有高活性的Split-PE1024變體, 并通過雙AAV8分別包裝split-PE1024的N端和C端(分別帶有pegRNA和gRNA)，通過視網膜下腔注射在視網膜區域實現靶基因Dnmt1 (p.P55Q, c.G164T)的堿基顛換。通過深度測序檢測靶位點的編輯效率，結果發現CMV啟動子和EF1α核心啟動子驅動的split-PE1024都成功在視網膜Dnmt1基因位點實現+5 G-to-T的堿基顛換。
圖1：雙AAV介導Split-PE1024誘導小鼠眼底視網膜點突變
研究成果“Dual-AAV delivering split prime editor system for in vivo genome editing”近期發表在Molecular Therapy雜志。該研究構建的雙AAV介導的Split-PE系統成功在小鼠視網膜實現精準的體內編輯，為遺傳病的體內治療提供有效的工具。
我校生命科學學院黃軍就教授和梁普平副教授為該論文的共同通訊作者，博士生支勝堯和陳昱僖博士為論文共同第一作者。該研究得到國家重點研發計劃、國家自然科學基金等項目資助。
