中大新聞網訊（通訊員張璋）RNA被認為是生命出現伊始就存在的生物大分子。漫長的演化歷程中，RNA逐漸從生命信息存儲和表達的雙重身份中特化出來，成為傳遞信息的媒介。處在中心法則中間的RNA，即不像DNA存儲遺傳信息，也不像蛋白質直接體現生命活動，只有以少數特例存在的形式下，如病毒、核酶，還提醒人們它仍然保留來自遠古的使命。近年來，表觀轉錄組學（epitranscriptomics）學說的提出為該領域注入了新的思想。人們發現，真核生物不同種類RNA上存在超過150種不同的化學修飾，其中很大部分繼承于古老的共同祖先。這些修飾或參與了RNA與其它大分子的互作，或影響了RNA本身的代謝，在生命過程中起著至關重要的作用。
準確且定量地鑒定RNA修飾位點及其修飾比例，是深入了解RNA修飾的分布、功能及其背后的機理機制的前提。然而如何得到高置信度、單堿基精度RNA修飾位點，以及對修飾位點的精準定量是目前領域內的研究難點。近年來，多種新技術的出現使得檢測全轉錄組中的各種RNA修飾位點成為可能。盡管領域內已有多種RNA修飾檢測方法可供選擇，但是在實際應用中效果往往差強人意。高假陽性率、低分辨率的問題時常困擾研究者。某些情況下，不同研究報道的同一種修飾的位點數甚至能相差2-3個數量級。即使是目前相對成熟、應用最廣的MeRIP-seq技術，也存在大量非特異性抗體富集和低重復性問題。
為了解決RNA修飾檢測中所面臨的方法學難題，中山大學生命科學學院駱觀正教授團隊提出了一種新的方法。通過構建全轉錄組無修飾RNA文庫作為負對照，全面評估了現有基于二代測序的RNA修飾檢測技術，并為修飾位點的精確鑒定提供系統的解決方案。該研究成果發表在Nature Methods雜志上，題為"Systematic calibration of the epitranscriptomic maps using a synthetic modification-free RNA library "。中山大學生命科學學院為第一署名單位，副研究員張璋和博士后陳濤為共同第一作者，駱觀正教授為通訊作者。文中所涉及到的方法已申請發明專利。
面對噪音較大的生物數據，引入對照來鑒別假陽性是經典的思路。在前人的研究中，為了提高現有修飾檢測方法的可信度，有時會利用負對照樣本對結果進行校正。比如有研究使用敲除甲基轉移酶(“writer”)的樣品作為對照。或者利用去甲基紅酶（eraser）在體外反應獲得去除修飾的樣本，亦或是使用合成的無修飾的RNA oligo。然而這些負對照樣本身存在較大的不足，比如體外反應很難完全去掉修飾位點，合成的RNA oligo只能代表部分序列等。因此，最好的負對照樣本應該具有與內源轉錄組同樣的序列和基因表達水平，但是并不含有修飾堿基的一套完整的人工轉錄組。本研究采用體外合成全轉錄組RNA (IVT RNA) 文庫的方法構建了無修飾的RNA文庫（圖1），隨后將其作為負對照用來校正現有的修飾檢測方法。文中以兩種最受關注的RNA修飾m6A和m5C作為代表，分別驗證了該方法在三種典型研究場景中的有效性（圖2）。
圖1 體外合成RNA文庫（IVT RNA）具有與內源轉錄組相似的表達量，但不含有修飾堿基。
圖2 使用IVT RNA校準RNA修飾檢測的三個應用場景。
MeRIP-seq（或m6A-seq）是目前最常用的RNA修飾檢測方法，被大范圍的用在m6A相關研究中。該方法原理是用m6A特異性的抗體對片段化的RNA進行免疫沉淀反應，將含有m6A的片段富集出來進行測序。在研究同時對體外轉錄IVT RNA文庫也進行MeRIP-seq，結果表明即使是對不含m6A修飾的IVT RNA文庫，抗體依舊能夠富集到大量RNA片段，并且這些富集的“peak”在已發表結果數據中重復出現，表明MeRIP-seq其實受到假陽性信號的嚴重干擾。分析IVT RNA中被富集下來的區域，發現這些區域所在的基因表達量較高且富含腺嘌呤。去除假陽性信號后，鑒定出來的修飾區域更準確（圖3）。
圖3 使用IVT RNA文庫對MeRIP-seq進行校正。
m6A-REF-seq是一種借助m6A敏感內切核酸酶MazF來實現的m6A單堿基檢測方法。該方法由駱觀正課題組和以色列魏茨曼科學研究學院Schraga Schwartz組在2019年分別獨立發表（詳見Cell+Sci Adv共同關注丨抗體非依賴m6A精準鑒定方法，助力解決領域內重大爭議https://mp.weixin.qq.com/s/nokmeX7gt5VoiuKK4iepKw）。在本研究中，作者將IVT RNA樣本作為負對照進行m6A-REF-seq校正，發現確實存在大量假陽性位點。高精準度的m6A單堿基圖譜也為領域提供了新的知識，如擴展motif序列，定量分布規律等，為進一步深入分析m6A的機制和功能創造了前提。通過對假陽性位點的深入分析，發現某些特定序列和RNA二級結構會干擾MazF酶切反應，是產生假陽性的主要原因（圖4）。
圖4 使用IVT RNA文庫對m6A-REF-seq進行校正。
最后該研究把IVT RNA應用到另一種常見RNA修飾m5C的檢測中。BS-seq使用重亞硫酸鹽對不含修飾的C進行處理，使其在PCR之后轉換為T，而m5C修飾并不能進行該轉換。在研究中如果處理不完全，會引入大量的假陽性位點。該研究在BS-seq中加入IVT RNA作為負對照，得到高置信度的m5C位點，同時發現即使重亞硫酸鹽處理得不是非常嚴格，引入IVT RNA依然能夠起到明顯的校正效果，降低了檢測結果中的假陽性率。
綜上，該研究提出了一種體外合成全轉錄組無修飾RNA的技術，并應用于三類主要的RNA修飾檢測方法中，系統性地對常用的RNA修飾檢測方法進行評估和校正，提高了修飾位點檢測的準確性，獲得了高置信度位點信息和定量圖譜。相對于使用體內敲除甲基轉移酶樣本作為負對照，該方法可以保證合成的RNA庫完全無修飾，且可以通過簡單的方式快速獲得，不受物種和樣本本身的限制，有望成為目前和未來RNA修飾檢測的金標準。
