中大新聞網訊（通訊員駱觀正）自從科學家們研究清楚CRISPR-Cas系統的作用機理并將其應用于真核細胞的基因編輯后，相關工具的開發、改造和應用呈爆發式增長，成為生物學研究的重要手段。目前主要的CRISPR編輯工具有Cas9、Base editor (BE)和Prime editor (PE)，及衍生的各種工具。CRISPR編輯工具在基因功能研究、轉錄調控、表觀遺傳修飾和基因治療等眾多研究領域具有重要應用和廣闊前景。但是，CRISPR介導的編輯工具普遍具有gRNA依賴的脫靶效應，會導致意料之外的基因編輯所帶來的不可預知的后果, 特別是臨床應用中的潛在脫靶風險。因此，定義和改進這些編輯工具的全基因組或全轉錄組的特異性，對于充分發揮它們在基礎研究和生物醫學治療中的全部潛力至關重要。此外，在工具的開發和改進中，特異性的精確評估，是工具的合理化選擇和針對性優化的基礎。總之，全面而精確地評估CRISPR編輯工具的脫靶效應是基因編輯領域的熱點和難點。
近幾年，科學家們已經開發了多種基于下一代測序（NGS）的脫靶檢測方法，以評估特定工具的特異性和準確性。例如，Digenome-seq、SITE-seq和CIRCLE-seq等方法通過直接檢測核酸酶切割位點，在體外分析CRISPR-Cas9的全基因組脫靶效應。但是，因為體外切割活性與體內編輯活性的相關性很低，所以體外方法具有非常高的假陽性。基于細胞的方法（體內方法），例如BLESS/BLISS、HTGTS、IDLV、GUIDE-seq，可以在體內對脫靶位點進行有效檢測。然而，它們容易受到內源性細胞活動的干擾，如DNA自發損傷、DNA修復、細胞分裂、供體序列整合等，影響脫靶檢測的靈敏度。堿基編輯器和先導編輯器不誘導雙鏈DNA斷裂，從而在很大程度上避免了基因治療中的意外編輯，但在臨床應用之前，對其脫靶效應進行全面評估至關重要。研究人員已經建立了Digenome-seq衍生的方法來識別BE（ABE7.10和BE3）的脫靶效應，盡管它只能應用于體外系統，并且傾向于高估脫靶位點的數量。最近報道的基于dU檢測和富集的Detect-seq可以在體內評估CBE的特異性。nDigenome-seq是第一種檢測PE脫靶效應的方法，它依賴于體外Cas9 H840A切口酶誘導的SSB。重要的是，上述方法只適用于特定類型的工具，不能兼容細胞外和細胞內環境，而且每種方法都有各自的局限性，通用、高效、可擴展的脫靶檢測方法仍匱乏。
鑒于以上背景，中山大學生命科學學院駱觀正教授團隊提出一種通用、高效、可擴展的脫靶檢測方法，可以系統地評估快速增長的CRISPR DNA編輯器家族中多個成員的脫靶效應，將有助于更深入地理解CRISPR介導的工具，以實現更廣泛的應用場景。最近芝加哥大學何川教授課題組報道了檢測轉錄活動中瞬時形成R-loop的技術KAS-seq。其中關鍵的N3-kethoxal分子可以在體外和原位高度特異地標記和捕獲ssDNA。本研究利用了CRISPR工具的一個共同特征，即依賴于RNA引導的位點特異性DNA識別會形成R-loop結構并暴露出ssDNA。因此，通過檢測靶向識別誘導產生的R-loop的ssDNA，就可以獲知基于CRISPR基因編輯工具的靶向和脫靶位點。根據上述原理，本研究成功開發了CROss-seq，并在體外和體內全面而系統地評估了Cas9、BE（CBE和ABE）和PE的靶向特異性。本研究發現，體外和體內的脫靶檢測方法具有明顯的差異，其中染色質可及性對脫靶活性有顯著影響，強調了結合體外和體內實驗進行交叉驗證的必要性。此外，CROss-seq可同時檢測BE系統的體外、體內脫靶位點，并交叉驗證體內脫靶位點的編輯，比單一體內或體外的方法具有更高的靈敏度和準確度。最后，CROss-seq可實現PE系統的體內脫靶位點檢測和編輯驗證，相關結果表明PE系統具有非常高的靶向特異性。綜上所述，CROss-seq可以幫助更好地評估當前可用的，以及未來可能的CRISPR 基因組編輯工具的脫靶效應，為促進CRISPR編輯工具在基礎研究和基因治療中的廣泛應用提供方法學創新。
圖：小分子標記基因編輯靶位點單鏈區
該研究“Systematic identification of CRISPR off-target effects by CROss-seq”近日發表在Protein & Cell雜志上。中山大學生命科學學院博士生李言、支勝堯，芝加哥大學吳桐博士為該論文共同第一作者，中山大學生命科學學院駱觀正教授、梁普平副教授和芝加哥大學何川教授為共同通訊作者。中山大學生命科學學院博士生陳鴻萱、馬冬曌和康睿參與了該項工作，松陽洲教授對論文進行了指導。本研究得到國家科技重大專項、國家自然科學基金、廣東省自然科學基金、廣東省專項支持計劃等項目的資助。
論文鏈接：https://doi.org/10.1093/procel/pwac018
