中大新聞網(wǎng)訊（通訊員熊麗娜）人類基因組是由約30 億個(gè)字符組成的遺傳“密碼本”，決定細(xì)胞和個(gè)體發(fā)育的命運(yùn)。該“密碼本”的98%字符都是具有“暗物質(zhì)”之稱的非編碼序列，而且約80%能夠轉(zhuǎn)錄成為 “暗物質(zhì)”核糖核酸（RNA）。這些“暗物質(zhì)”RNA大多數(shù)都是不具有帽子結(jié)構(gòu)的RNA（noncapped RNA，napRNA），且普遍作為非編碼RNA（ncRNA）在基因表達(dá)調(diào)控和疾病發(fā)生發(fā)展中扮演了重要角色。然而，目前的研究主要集中于具有帽子結(jié)構(gòu)的RNA（capped RNA，capRNA）和短的napRNA，人們對(duì)長的napRNA（序列長度≥100核苷酸）的種類組成、結(jié)構(gòu)、生物生成及功能機(jī)制都知之甚少。
2024年3月18日，生命科學(xué)學(xué)院的楊建華/屈良鵠/李斌團(tuán)隊(duì)在Nature Communications期刊上發(fā)表了題為“NAP-seq reveals multiple classes of structured noncoding RNAs with regulatory functions”的研究論文。該研究開發(fā)了NAP-seq測(cè)序技術(shù)和napSeeker算法，在單堿基精度鑒定具有各種末端修飾的napRNA的全長序列，發(fā)現(xiàn)多種新類型napRNA和成百上千的新結(jié)構(gòu)型ncRNA，解析它們?cè)诓煌募?xì)胞刺激和骨骼肌分化階段的動(dòng)態(tài)變化圖譜，揭示了napRNA的表達(dá)、結(jié)構(gòu)特征、生物生成特性及其在細(xì)胞活動(dòng)中的功能機(jī)制，為在各種生物中發(fā)現(xiàn)新的結(jié)構(gòu)型napRNA及其功能機(jī)制研究提供了新方法和新思路。
由于napRNA一般不具有polyA尾，因此傳統(tǒng)的利用PolyA富集的RNA-seq方法無法鑒定napRNA。即使是測(cè)定total RNA的RNA-seq方法，由于通過隨機(jī)六聚體引物對(duì)片段化的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄（RT）產(chǎn)生cDNA，也導(dǎo)致無法鑒定全長的napRNA序列和不能用于分類napRNA及不能用于確定其二級(jí)結(jié)構(gòu)等等。雖然通過小RNA測(cè)序（sRNA-seq）技術(shù)測(cè)定短napRNA發(fā)現(xiàn)了一些功能性小非編碼RNA（如：miRNA，piRNA），然而幾乎所有涉及sRNA-seq的研究都集中在小于50 核苷酸的napRNA，而不是各種長度和不同末端修飾的所有napRNA，尤其是長鏈（≥100 核苷酸）和結(jié)構(gòu)復(fù)雜的napRNA。針對(duì)這些問題，研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種捕獲長鏈napRNA的全長序列的新測(cè)序方法—NAP-seq，具體的簡化步驟包括：對(duì)RNA樣品進(jìn)行除雜、T4 PNK修復(fù)RNA末端、長度篩選、自主設(shè)計(jì)的3’端接頭和5’端接頭連接、非目標(biāo)RNA的去除、巢式RT-PCR與預(yù)擴(kuò)增、可選地片段化、在兩種不同的測(cè)序平臺(tái)（Oxford Nanopore三代單分子測(cè)序平臺(tái)和Illumina二代測(cè)序平臺(tái)）測(cè)序和開發(fā)新算法鑒定napRNA等步驟（圖1）。
圖1. NAP-seq的技術(shù)流程
研究團(tuán)隊(duì)將NAP-seq技術(shù)應(yīng)用于多種人細(xì)胞系、細(xì)胞應(yīng)激和小鼠骨骼肌分化模型，在人類和小鼠中發(fā)現(xiàn)多種新類結(jié)構(gòu)型napRNA，包括穩(wěn)定表達(dá)的線性內(nèi)含子napRNA（sliRNA）、snoRNA-內(nèi)含子雜合napRNA（snotron）、嵌在miRNA間隔區(qū)的napRNA（misRNA），以及數(shù)千個(gè)新結(jié)構(gòu)型napRNA（圖2），并解析了這些napRNA可能的生物生成過程（biogenesis）。此外，研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步聯(lián)合了NAP-seq和SHAPE-MaP等技術(shù)發(fā)展了NAP-SHAPE-MaP方法，解析了這些napRNA在體內(nèi)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。而且，通過RNA半衰期分析和表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，napRNA在細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)并在不同的細(xì)胞刺激和分化階段發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，這提示napRNA可能具有調(diào)控功能。有趣的是，研究團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)基因組的各種重復(fù)元件（repetitive element）可以轉(zhuǎn)錄和加工成多類新結(jié)構(gòu)型ncRNA（repRNA），包括box C/D，box H/ACA和聚合酶III轉(zhuǎn)錄的ncRNA。重要的是，NAP-seq鑒定到目前為止最長的新結(jié)構(gòu)型box C/D和H/ACA基因，展現(xiàn)出它能發(fā)掘各種長度napRNA的強(qiáng)大潛能。
研究團(tuán)隊(duì)通過功能獲得、功能缺失和堿基突變等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，小鼠骨骼肌分化過程中下調(diào)表達(dá)的一個(gè)新結(jié)構(gòu)型napRNA（mmu-novel-CD-6）具有抑制骨骼肌細(xì)胞分化的潛在調(diào)控功能。通過進(jìn)化保守性分析和NAP-SHAPE-MaP結(jié)構(gòu)測(cè)序分析，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的結(jié)構(gòu)型napRNA—DINAP，它是一個(gè)包含box C/D和box H/ACA結(jié)構(gòu)的雜合napRNA分子。DINAP從人到非洲爪蟾進(jìn)化高度保守，提示DINAP可能行使重要的生物學(xué)功能。為了解析DINAP的生物學(xué)功能，研究團(tuán)隊(duì)利用自主開發(fā)的starBase5平臺(tái)進(jìn)行互作蛋白組分析并完成多個(gè)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)和證實(shí)DINAP與假尿嘧啶合成酶DKC1相互作用。通過進(jìn)一步利用放線菌酮追蹤實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DINAP與DKC1蛋白互作會(huì)影響DKC1蛋白的穩(wěn)定性。而且細(xì)胞表型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DINAP通過維持DKC1蛋白的穩(wěn)定性來促進(jìn)細(xì)胞增殖（圖2）。
綜上所述，這項(xiàng)研究工作通過開發(fā)多種新實(shí)驗(yàn)策略和計(jì)算機(jī)算法以及結(jié)合二代測(cè)序（Illumina）和三代單分子測(cè)序（Nanopore）平臺(tái)實(shí)現(xiàn)了napRNA的全長測(cè)序（圖2），聯(lián)合團(tuán)隊(duì)前期在Nature Biotechnology期刊發(fā)表的RIP-PEN-seq/PEN-seq技術(shù)，可以測(cè)定任何長度的napRNA和ncRNA。這些方法為探究現(xiàn)代“RNA世界”中的重要“新大陸(novel napRNA)”開辟了新途徑。
圖2. napRNA的系統(tǒng)發(fā)掘及功能機(jī)制研究
生命科學(xué)學(xué)院的楊建華教授、屈良鵠教授和李斌副教授為本文通訊作者，中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院特聘副研究員劉樹榕和博士研究生黃鈞鴻為本文的共同第一作者；該研究得到實(shí)驗(yàn)室其他成員的大力支持。中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院為第一作者單位。本研究受到科技部重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目、國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助。
