中大新聞網訊（通訊員楊建華）RNA除了用來合成蛋白質的遺傳密碼之外，還嵌入了第二層遺傳信息—即RNA高級結構和序列基序1。因此，揭示具有特定結構和序列基序（motif）的新類型非編碼RNA (ncRNA) 及其功能機制是理解細胞遺傳信息傳遞的核心任務之一。NcRNA通常通過不同的二級或三級RNA結構基序與 RNA 結合蛋白 (RBP) 相互作用去執行調控功能。其中，Kink-turn (K-turn) 結構是一類幾乎存在所有生物中的三級（3D）RNA結構基序，并廣泛存在于mRNA與各類ncRNA中。K-turn結構及其結合蛋白15.5K在RNA代謝和疾病發生發展過程中發揮重要的調控功能。然而由于目前缺乏有效的實驗與計算機技術去鑒定具有K-turn結構的RNA（ktRNA），因此K-turn結構在轉錄組中的分布、表達、結構特性及功能機制都有待全面闡釋。
中山大學生命科學學院的楊建華和屈良鵠教授團隊開發了RIP-PEN-seq/PEN-seq/sub-PEN-seq等測序技術和kturnSeeker算法發現在固定位置出現后向（backward）K-turn結構和序列基序的新類型ncRNA（bktRNA），并解析了它們的表達、折疊結構特性及其在RNA剪接和修飾中的功能機制，為發現新的ktRNA/ncRNA及其功能機制研究提供了新方法和新思路。
由于目前的RIP-seq和RNA-seq方法經常對長度大于50個核苷酸（nt）的RNA進行片段化及利用隨機引物進行RT-PCR擴增后測序，從而導致這些方法無法測定全長的ncRNA和無法發現 ncRNA 上的序列和結構基序及其距離RNA末端的精確位置。針對這些問題，研究團隊首先通過開發RIP-PEN-seq技術去測定人和小鼠中與15.5K蛋白互作的全長ncRNA分子（20-500個核苷酸），并進一步根據K-turn結構特性開發了kturnSeeker算法分析這些RIP-PEN-seq測序數據（圖1）。kturnSeeker軟件除了鑒定絕大多數已知的前向（forward） ktRNA（fktRNA）和600多個新的fktRNA，還發現390多個新的后向ktRNA。
研究團隊通過結構和基序富集分析這些新的后向ktRNA，發現它們都具有以下的規律性特征：（1）具有后向K-turn結構基序；（2）后向K-turn結構基序具有距離這些ktRNA的5'端4個核苷酸和3'端2個核苷酸的規律；（3）后向K-turn結構的5'端包含了CUGA及3'端包含了UGAUG的保守基序。應用RIP-PEN-seq和kturnSeeker于小鼠的細胞同樣發現以上的規律性特征。此外，研究團隊進一步聯合了RIP-PEN-seq和SHAPE-MaP等技術發展了RIP-PEN-SHAPE-MaP方法證實了后向ktRNA的確是以這3個結構和序列特征形成K-turn并與15.5K蛋白互作。因此基于這些規律性特征，它們被命名為具有規律性后向K-turn結構基序的新類型ncRNA（bktRNA）。
圖1 開發新的RIP-PEN-seq測序技術和計算機算法kturnSeeker發現人類的bktRNA
研究團隊進一步開發PEN-seq和sub-PEN-seq技術應用于人類各種細胞和亞細胞組分，并利用kturnSeeker分析這些和公共的測序數據鑒定了超過390個bktRNA，發現它們的長度范圍從20到500個核苷酸，具有一定的組織細胞特異性，且主要分布于細胞核內?；诨蚪M結構和序列保守性分析，發現bktRNA主要位于各種基因的內含子區域；部分bktRNA在進化上是很保守的（bktRNA1從人到斑馬魚保守），但有很多人類的bktRNA只在靈長類保守。通過對bktRNA進行結構折疊（folding）特性分析發現它們與其它依賴金屬離子折疊的ktRNA明顯不一樣，bktRNA的序列組成及其與15.5K蛋白的互作可能共同決定了其折疊成穩定的后向K-turn結構。
研究團隊通過分析保守的bktRNA1基因二級結構的共進化和SHAPE信號值，發現它是一個由后向K-turn結構基序與box H/ACA snoRNA (SNORA12)構成的嵌合ncRNA分子 （圖2）。在不同細胞類型中的亞細胞定位分析都發現bktRNA1主要存在于Cajal Body中。同時，通過刪除和突變bktRNA1的后向K-turn結構發現后向K-turn結構基序對于bktRNA1的加工、成熟及穩定存在是必不可少的。
圖2 進化保守的bktRNA1的二級結構及其折疊特征信號
為了研究這些bktRNA在體內可能靶向哪些RNA而發揮調控功能，研究團隊通過15.5K蛋白的CLASH測序，發現進化保守bktRNA1在細胞內與minor splicesome（次要剪接體）中的U12 snRNA形成14個堿基的互補配對。分析RNA-RNA互作的PARIS測序數據也證明bktRNA1與U12 snRNA形成這個長互補配對。由于U12上的配對區域具有2'-O-甲基化修飾（2'-O-Me）且配對區毗鄰一個類似K-turn的結構（K-turn like），因此猜想bktRNA1可能指導2'-O-甲基轉移酶FBL催化U12的2'-O-甲基化修飾。為了驗證這個猜想，研究團隊使用FBL蛋白的CLASH測序進一步證實bktRNA1與U12 snRNA形成長的完全互補配對。并通過開發基于熒光標記的引物延伸技術（irPE）及利用CRISPR/Cas9敲除技術和回復實驗等手段，證實了bktRNA1及其后向K-turn結構基序對于介導U12 snRNA的第八位腺嘌呤核苷酸（Am8）的2'-O-甲基化修飾是必不可少的。
研究團隊進一步通過對四組刪除不同區域的bktRNA1-KO細胞進行RNA-seq測序及剪接分析，發現敲除bktRNA1影響超過75%的U12型內含子剪接。進一步通過qPCR和RT-PCR及回復實驗證實了bktRNA1及U12上的2'-O-甲基化修飾決定了U12 型剪接的保真度。通過Northern Blot、ChIRP、RNA pull-down和RNA EMSA等實驗手段對次要剪接體及U12 snRNA進行分析發現bktRNA1的缺失導致ZCRB1不能結合到次要剪接體。同時，對敲低ZCRB1的細胞進行測序和細胞表型分析發現bktRNA1與ZCRB1對U12內含子剪接及細胞表型影響都是一致的。這些結果表明由bktRNA1介導的U12 上2'-O-甲基化修飾對于將ZCRB1募集到 U11–U12 di-snRNP復合體以及U12型內含子的剪接是必須的。
為了研究其他bktRNA在RNA剪接加工的作用，研究團隊基于GFP內含子報告載體研究了多個突變后向K-turn結構基序的bktRNA，發現基序突變會影響超過80%隨機選擇的bktRNA所在內含子的剪接加工（local intron splicing，局部內含子剪接）。進一步通過利用Prime Editing技術也證實在體內突變后向K-turn結構基序會影響與15.5K蛋白的結合和局部內含子剪接。這些結果表明bktRNA是依賴于后向K-turn結構基序調控局部內含子剪接。
綜上所述，這項研究工作通過開發多種新實驗方法和計算機算法發現了在固定位置具有后向K-turn結構和序列基序的新類型bktRNA，揭示了由bktRNA、RNA甲基化和RNA剪接體的相互作用（crosstalk）形成的新層次基因表達調控機制（圖3）。這項工作將為發現其他bktRNA/ncRNA及剖析它們在細胞和疾病中的功能機制研究打開了大門和提供全新的解決方案。
圖3 bktRNA的系統鑒定及功能機制研究
近日，該研究以“RIP-PEN-seq identifies a class of kink-turn RNAs as splicing regulators”為題在Nature Biotechnology上發表。中山大學生命科學學院為第一作者單位。本工作受到科技部重點研發項目、國家自然科學基金項目資助。
