中大新聞網(wǎng)訊（通訊員駱觀正）自從在真核生物DNA上重新發(fā)現(xiàn)N6-deoxyadenosine（6mA）修飾以來(lái)，研究人員對(duì)其能否成為新的表觀遺傳標(biāo)記充滿期待。隨著研究的進(jìn)展和新方法的開(kāi)發(fā)，研究者們聲稱6mA存在于各種真核生物中，包括植物、脊椎動(dòng)物，甚至哺乳動(dòng)物。然而，現(xiàn)有方法的不足限制了6mA的精確定位和功能解釋。近年來(lái)關(guān)于6mA是否存在于哺乳動(dòng)物中以及其能否成為新的遺傳學(xué)標(biāo)記的重要性問(wèn)題引起了廣泛的爭(zhēng)論。因此，開(kāi)發(fā)一種敏感和可靠的檢測(cè)方法來(lái)確定6mA的存在以及基因組中真正的6mA位點(diǎn)的精確定位至關(guān)重要，特別是對(duì)于6mA水平非常低的生物。
中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院駱觀正教授長(zhǎng)期專注于表觀遺傳相關(guān)研究，前期工作發(fā)現(xiàn)了6mA在真核生物中是一種可能的新型表觀遺傳標(biāo)記（Cell, 2015），并對(duì)其在高等生物中潛在的生物學(xué)功能進(jìn)行了總結(jié)和展望（Nat Rev Mol Cell Bio, 2015; Nat Struc Mol Bio, 2017）。近日，駱觀正教授團(tuán)隊(duì)報(bào)道了一種基于新的檢測(cè)原理的全基因組6mA檢測(cè)新方法MM-seq (Modification-induced Mismatch Sequencing)，并利用該方法評(píng)估了6mA在細(xì)菌、綠藻和哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的基因組位置，揭示了人類不同細(xì)胞類型擁有非常有限的6mA位點(diǎn)，這些位點(diǎn)零星分布在不同的基因組定位上。敲除RNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3后，基因組DNA中可檢測(cè)到的6mA位點(diǎn)進(jìn)一步減少。
該研究中發(fā)現(xiàn)在雙鏈DNA中，6mA特異性抗體可以識(shí)別嵌入在DNA雙鏈上的修飾腺嘌呤。在研究了6mA的化學(xué)性質(zhì)后，研究者推測(cè)6mA的存在減弱了堿基的堆積，并使局部DNA雙鏈不穩(wěn)定。研究者通過(guò)高錳酸鉀足跡法證實(shí)了雙鏈DNA上的N6 -脫氧腺苷促進(jìn)了類似錯(cuò)配結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生，其機(jī)制可能是通過(guò)DNA呼吸或堿基翻轉(zhuǎn)。這種獨(dú)特的類錯(cuò)配結(jié)構(gòu)允許6mA被6mA特異性抗體捕獲，隨后被特定的核酸酶或化學(xué)裂解反應(yīng)識(shí)別。隨后，根據(jù)這一原理開(kāi)發(fā)了一種全新的6mA定位方法MM-seq (modified -induced Mismatch Sequencing)（圖1）。
圖1. KMnO4足跡法檢測(cè)6mA誘導(dǎo)的錯(cuò)配樣結(jié)構(gòu)
鑒于MM-seq的高精度，研究人員隨后將該方法應(yīng)用于6mA水平較低或常規(guī)測(cè)序方法無(wú)法檢測(cè)到的哺乳動(dòng)物細(xì)胞當(dāng)中。結(jié)果發(fā)現(xiàn)多種人類細(xì)胞類型其基因組DNA上含有非常有限的6mA位點(diǎn)，這些位點(diǎn)隨機(jī)分布在不同的基因組位置上，不同細(xì)胞中的位點(diǎn)重復(fù)性極低。考慮到雖然這些單堿基6mA位點(diǎn)非常罕見(jiàn)，但這些有限的位點(diǎn)可能富集在特定的基因組區(qū)域，并發(fā)揮重要的調(diào)控作用。因此，進(jìn)一步研究了6mA位點(diǎn)是否有聚集在特定區(qū)域的趨勢(shì)，特別是在基因組或線粒體DNA的重復(fù)元件(REs)上。結(jié)果發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)IP鑒定的6mA峰在REs處富集，然而，MM-seq鑒定的位點(diǎn)在此并無(wú)富集，提示之前研究中發(fā)現(xiàn)的6mA富集在重復(fù)元件的現(xiàn)象很可能是因?yàn)榉椒ǖ募訇?yáng)性造成的。
針對(duì)哺乳動(dòng)物中6mA含量極低的特征，最近有研究提出6mA是由于RNA上修飾堿基經(jīng)過(guò)消化代謝，被DNA聚合酶隨機(jī)整合進(jìn)DNA的觀點(diǎn)。為了驗(yàn)證這一觀點(diǎn)，研究人員進(jìn)一步敲除RNA m6A甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3后再進(jìn)行MM-seq檢測(cè)。結(jié)果表明，基因組DNA中可檢測(cè)到的6mA位點(diǎn)進(jìn)一步減少，該研究結(jié)果支持了哺乳動(dòng)物基因組中有限的6mA可能源于RNA m6A的代謝副產(chǎn)物。
綜上，該研究不僅提供了一種全新的方法來(lái)全面和準(zhǔn)確地繪制多個(gè)物種中6mA的分布，而且還將加深對(duì)罕見(jiàn)DNA修飾的理解。近日，該研究成果“High-precision mapping reveals rare N6-deoxyadenosine methylation in the mammalian genome”在Cell Discovery雜志上發(fā)表，陳麗倩博士（現(xiàn)為廣東省人民醫(yī)院博士后）和張璋副教授為共同第一作者，駱觀正教授為通訊作者，課題組成員陳鴻萱、奚劍飛、劉學(xué)弘、馬冬曌、鐘宇浩、黃文慧、陳濤參與了該工作。香港大學(xué)Daniel W. Mak、中山大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（深圳）的陳琦和陳耀慶對(duì)該論文提供了幫助。文中所涉及到的方法已申請(qǐng)發(fā)明專利。
