中大新聞網(wǎng)訊（通訊員駱觀正）自從科學(xué)家們研究清楚CRISPR-Cas系統(tǒng)的作用機(jī)理并將其應(yīng)用于真核細(xì)胞的基因編輯后，相關(guān)工具的開(kāi)發(fā)、改造和應(yīng)用呈爆發(fā)式增長(zhǎng)，成為生物學(xué)研究的重要手段。目前主要的CRISPR編輯工具有Cas9、Base editor (BE)和Prime editor (PE)，及衍生的各種工具。CRISPR編輯工具在基因功能研究、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、表觀遺傳修飾和基因治療等眾多研究領(lǐng)域具有重要應(yīng)用和廣闊前景。但是，CRISPR介導(dǎo)的編輯工具普遍具有g(shù)RNA依賴的脫靶效應(yīng)，會(huì)導(dǎo)致意料之外的基因編輯所帶來(lái)的不可預(yù)知的后果, 特別是臨床應(yīng)用中的潛在脫靶風(fēng)險(xiǎn)。因此，定義和改進(jìn)這些編輯工具的全基因組或全轉(zhuǎn)錄組的特異性，對(duì)于充分發(fā)揮它們?cè)诨A(chǔ)研究和生物醫(yī)學(xué)治療中的全部潛力至關(guān)重要。此外，在工具的開(kāi)發(fā)和改進(jìn)中，特異性的精確評(píng)估，是工具的合理化選擇和針對(duì)性優(yōu)化的基礎(chǔ)。總之，全面而精確地評(píng)估CRISPR編輯工具的脫靶效應(yīng)是基因編輯領(lǐng)域的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。
近幾年，科學(xué)家們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了多種基于下一代測(cè)序（NGS）的脫靶檢測(cè)方法，以評(píng)估特定工具的特異性和準(zhǔn)確性。例如，Digenome-seq、SITE-seq和CIRCLE-seq等方法通過(guò)直接檢測(cè)核酸酶切割位點(diǎn)，在體外分析CRISPR-Cas9的全基因組脫靶效應(yīng)。但是，因?yàn)轶w外切割活性與體內(nèi)編輯活性的相關(guān)性很低，所以體外方法具有非常高的假陽(yáng)性?；诩?xì)胞的方法（體內(nèi)方法），例如BLESS/BLISS、HTGTS、IDLV、GUIDE-seq，可以在體內(nèi)對(duì)脫靶位點(diǎn)進(jìn)行有效檢測(cè)。然而，它們?nèi)菀资艿絻?nèi)源性細(xì)胞活動(dòng)的干擾，如DNA自發(fā)損傷、DNA修復(fù)、細(xì)胞分裂、供體序列整合等，影響脫靶檢測(cè)的靈敏度。堿基編輯器和先導(dǎo)編輯器不誘導(dǎo)雙鏈DNA斷裂，從而在很大程度上避免了基因治療中的意外編輯，但在臨床應(yīng)用之前，對(duì)其脫靶效應(yīng)進(jìn)行全面評(píng)估至關(guān)重要。研究人員已經(jīng)建立了Digenome-seq衍生的方法來(lái)識(shí)別BE（ABE7.10和BE3）的脫靶效應(yīng)，盡管它只能應(yīng)用于體外系統(tǒng)，并且傾向于高估脫靶位點(diǎn)的數(shù)量。最近報(bào)道的基于dU檢測(cè)和富集的Detect-seq可以在體內(nèi)評(píng)估CBE的特異性。nDigenome-seq是第一種檢測(cè)PE脫靶效應(yīng)的方法，它依賴于體外Cas9 H840A切口酶誘導(dǎo)的SSB。重要的是，上述方法只適用于特定類型的工具，不能兼容細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，而且每種方法都有各自的局限性，通用、高效、可擴(kuò)展的脫靶檢測(cè)方法仍匱乏。
鑒于以上背景，中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院駱觀正教授團(tuán)隊(duì)提出一種通用、高效、可擴(kuò)展的脫靶檢測(cè)方法，可以系統(tǒng)地評(píng)估快速增長(zhǎng)的CRISPR DNA編輯器家族中多個(gè)成員的脫靶效應(yīng)，將有助于更深入地理解CRISPR介導(dǎo)的工具，以實(shí)現(xiàn)更廣泛的應(yīng)用場(chǎng)景。最近芝加哥大學(xué)何川教授課題組報(bào)道了檢測(cè)轉(zhuǎn)錄活動(dòng)中瞬時(shí)形成R-loop的技術(shù)KAS-seq。其中關(guān)鍵的N3-kethoxal分子可以在體外和原位高度特異地標(biāo)記和捕獲ssDNA。本研究利用了CRISPR工具的一個(gè)共同特征，即依賴于RNA引導(dǎo)的位點(diǎn)特異性DNA識(shí)別會(huì)形成R-loop結(jié)構(gòu)并暴露出ssDNA。因此，通過(guò)檢測(cè)靶向識(shí)別誘導(dǎo)產(chǎn)生的R-loop的ssDNA，就可以獲知基于CRISPR基因編輯工具的靶向和脫靶位點(diǎn)。根據(jù)上述原理，本研究成功開(kāi)發(fā)了CROss-seq，并在體外和體內(nèi)全面而系統(tǒng)地評(píng)估了Cas9、BE（CBE和ABE）和PE的靶向特異性。本研究發(fā)現(xiàn)，體外和體內(nèi)的脫靶檢測(cè)方法具有明顯的差異，其中染色質(zhì)可及性對(duì)脫靶活性有顯著影響，強(qiáng)調(diào)了結(jié)合體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行交叉驗(yàn)證的必要性。此外，CROss-seq可同時(shí)檢測(cè)BE系統(tǒng)的體外、體內(nèi)脫靶位點(diǎn)，并交叉驗(yàn)證體內(nèi)脫靶位點(diǎn)的編輯，比單一體內(nèi)或體外的方法具有更高的靈敏度和準(zhǔn)確度。最后，CROss-seq可實(shí)現(xiàn)PE系統(tǒng)的體內(nèi)脫靶位點(diǎn)檢測(cè)和編輯驗(yàn)證，相關(guān)結(jié)果表明PE系統(tǒng)具有非常高的靶向特異性。綜上所述，CROss-seq可以幫助更好地評(píng)估當(dāng)前可用的，以及未來(lái)可能的CRISPR 基因組編輯工具的脫靶效應(yīng)，為促進(jìn)CRISPR編輯工具在基礎(chǔ)研究和基因治療中的廣泛應(yīng)用提供方法學(xué)創(chuàng)新。
圖：小分子標(biāo)記基因編輯靶位點(diǎn)單鏈區(qū)
該研究“Systematic identification of CRISPR off-target effects by CROss-seq”近日發(fā)表在Protein & Cell雜志上。中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生李言、支勝堯，芝加哥大學(xué)吳桐博士為該論文共同第一作者，中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院駱觀正教授、梁普平副教授和芝加哥大學(xué)何川教授為共同通訊作者。中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院博士生陳鴻萱、馬冬曌和康睿參與了該項(xiàng)工作，松陽(yáng)洲教授對(duì)論文進(jìn)行了指導(dǎo)。本研究得到國(guó)家科技重大專項(xiàng)、國(guó)家自然科學(xué)基金、廣東省自然科學(xué)基金、廣東省專項(xiàng)支持計(jì)劃等項(xiàng)目的資助。
論文鏈接：https://doi.org/10.1093/procel/pwac018
